固相肽合成成功的 5 个技巧和窍门

作为一名多肽应用科学家，我有幸与许多次涉足多肽世界的团队合作。尽管对于经验丰富的合成化学家来说似乎相当简单，但在固相肽合成中，生产可接受的产量和纯度肯定会带来独特的挑战。

在这篇文章中，我想介绍我在此过程中学到的一些提示和技巧。

当我开始研究生学习时，我很幸运，周围都是高年级研究生和博士后，他们愿意花时间帮助我解决在熟悉固相肽合成时遇到的挑战。尽管在合成肽的整个过程中只发生三到四个相对简单的有机反应，但经常会观察到粗产率和纯度的巨大变化结果。这些变化几乎总是由于特定的肽序列本身造成的。我在此列表中包含了一些我可靠的提示和技巧，这些提示和技巧可以可靠地导致成功的合成。

1. 增加氨基酸和偶联试剂溶液的浓度

这应该是有道理的。毕竟，必须完成两个独立的、浓度依赖性的双分子反应，才能将单个氨基酸添加到不断增长的肽链中。通过增加试剂浓度，您可以减小溶液体积，从而增加所需分子适当相互作用的可能性。氨基酸浓度的影响是显而易见的，特别是在较长肽的合成中。对于大多数肽，我通常会将氨基酸和偶联试剂溶液的浓度增加到 0.5 M。

2. 脯氨酸后双偶联输入的氨基酸

我肯定在含有脯氨酸的肽中取得了单偶联氨基酸的成功，我也有过在脯氨酸残基后惨遭失败的肽。可能的原因是活性氮是一种仲胺，反应性明显低于其他氨基酸。这一点容易通过注意到脯氨酸氮的 pKa 平均比所有其他氨基酸低 1 个完整的对数单位(10.6 对平均 9.5)，半胱氨酸除外。

图 1：脯氨酸的化学结构。活性氮以吡咯烷的形式存在，降低了其反应性。

3. 当连续有多个相同的氨基酸时，双偶联

对于一些仅包含单个氨基酸且侧链庞大的肽，这是有道理的(想想 Arg8)，但您会惊讶于合成 Ala8 有多么困难!通常，这些挑战是由于生长肽的溶解度降低或二级结构形成而出现的。然而，在剩余的肽序列中合成仅包含少量 (2-4) 线性序列相同氨基酸的肽也可能具有挑战性。连续的第二个或第三个相同氨基酸的双重偶联有助于减少缺失序列的存在，并提高整体肽的产量和质量。

4. 双偶联精氨酸残基

精氨酸可能是一个挑战，很难掺入任何肽序列中，主要是因为其庞大的侧链和相应的保护基团。当精氨酸与具有大侧链的氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)偶联时，这种情况尤其普遍。确保精氨酸完全掺入的一种简单方法是双偶联，尽管我也取得了一些成功，增加了分配的偶联时间。

图 2：受保护的酪氨酸(左上)、受保护的色氨酸(右上)、受保护的苯丙氨酸(左下)和保护精氨酸(右下)的化学结构。 出于空间考虑，Fmoc 组已缩写。

5. 注意天冬氨酸残留物

天冬氨酸在肽合成过程中易发生天冬氨酸重排。该副反应是碱催化的，可能在天冬氨酸残基掺入后的每个脱保护循环中的任何时间点发生，但具有一定的序列依赖性。重排将 β-氨基酸引入原本α-氨基酸肽中(参见下面的机制)。不幸的是，这种重排是质量中性的，几乎不可能通过色谱与天然肽分离。已经发布了几种策略来帮助限制或消除合成过程中这种副反应的可能性。

图 3：在固相肽合成中观察到的碱催化天冬酰胺重排机制。iso-Asp 副产品在 70% 的情况下受到青睐。文/伊丽莎白·丹顿